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本产品是一种利用新型荧光探针O08进行活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的O08 ROS探针为红色荧光的活性氧探针，具有510/610nm的最大激发/发射波长。
O08 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下，被氧化生成红色荧光物质，红色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测O08产物的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
在激发波长510nm，发射波长610nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、等检测O08产物荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
本产品可以用于各种动物细胞样本的检测。提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。


● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
● 背景低，灵敏度高；
● 线性范围宽，使用方便。
检测方法：
● 流式细胞仪● 荧光显微镜● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长510nm，发射波长610nm。● 离心机● 移液器● PBS ● HBSS(无酚红)

组份	100-500T	200-1000T
组份A：O08荧光探针	100μL	200μL
组份B：活性氧阳性对照诱导剂	1mL	1mL
说明书	1份	1份

探针-20℃避光保存，有效期6个月。
注：
● 探针长期不用可以-20℃保存。
● 阳性对照诱导剂需密封保存。减少开盖次数。
● 避免反复冻融。可以根据需要分装后冻存。
● 探针液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
● 对不同的细胞，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化。
● O08染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
● 选做，阳性对照诱导剂可以按照1:1000的比例使用。例如标记好探针的细胞共1mL，可以加入1μL的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照诱导剂的浓度。


探针标记
探针溶液可在新鲜无血清培养液、缓冲盐溶液中稀释到所需浓度，1000～10000倍稀释，以此染色液更换细胞培养液；也可直接向细胞孵育液体中加入探针溶液至所需浓度。
注：
● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度1000～10000倍稀释，1000～2000倍适合大多数细胞样本。
● 建议收到产品后，根据单次用量，对母液进行小量分装，每次用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
● 工作液现配现用。
依据细胞ROS含量的不同，O08探针终浓度可选择在1000～10000倍稀释的范围，孵育时间可选择10～90分钟，在37℃或室温进行避光孵育。
孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞或组织。
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1.按照1:1000～2000用无血清培养基稀释O08探针。
注：
● 不能用含有血清的培养基稀释O08探针。
● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
2.去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3.加入适当体积稀释好的O08探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的O08探针不少于1mL。
4.在37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。
5.用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O08探针。
注：
● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
● 前期细胞样本准备时仅在阳性对照孔中加入阳性对照诱导剂，其余孔不必加入。
● 通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。
● 阳性诱导剂根据需要使用，并非必须使用。如实验细胞模型已经制备有阳性对照细胞，也可以不使用。
收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1.按照1:1000用无血清培养基稀释O08探针。
注：
● 不能用含有血清的培养基稀释探针。
● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
2.离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。
3.细胞收集后悬浮于稀释好的O08探针中，细胞浓度为1×106～2×107/mL，37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
4.用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O08探针。
5.用无血清细胞培养基重悬细胞。
注：
● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
● 前期细胞样本准备时仅在阳性对照孔中加入阳性对照诱导剂，其余孔不必加入。
● 通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。
● 阳性诱导剂根据需要使用，并非必须使用。如实验细胞模型已经制备有阳性对照细胞，也可以不使用。
荧光显微镜检测：
1.对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25～50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2.荧光显微镜下，用绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS阳性细胞在整个核区被染成红色。
流式细胞仪分析：
1.对贴壁细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。
用0.5～1mL冰冷PBS重悬细胞（5～10万）。
2.采用480～535nm波长激发，测定590nm～610nm以上的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS阳性细胞有较强的红色荧光。
相关搜索：总活性氧(ROS)检测试剂盒(红色,O08)